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RNA逆转录成功的6大因素

来源:   发布时间 :2021-11-04  点击量:

逆转录(Reverse Transcription)是以RNA为模板,在逆转录酶的催化作用下,合成RNA/DNA杂合双链,然后水解杂合双链中的RNA,得到互补的单链cDNA的过程。得到的cDNA单链可以作为扩增模板,合成双链DNA。cDNA的合成可以用与后续的PCR实验、qpcr实验、基因检测、基因工程等各个领域。

逆转录实验成功的要素包含:逆转录酶、主要反应组分、引物的选择、gDNA去除等。

1.逆转录酶

大多数逆转录酶,主要包括以下三种活性:

①逆转录活性:以RNA为模板,催化dNTP聚合,生成DNA-RNA杂合双链。

②RNase H活性:水解杂合双链中的RNA,得到与RNA互补的DNA单链(cDNA)。

③DNA指导的DNA聚合酶活性:以cDNA单链为模板,以dNTP为底物,再合成双链DNA。

常见的逆转录酶包括AMV和M-MuLV逆转录酶,M-MuLV逆转录酶具有更高的热稳定性,并且降低了RNase H的活性。

2.单价阳离子

离子条件基本上影响各种模板的转录效率。K+的转录产物比Na+较长。对于cDNA长度的最适K+浓度为140-150 mM。

3.二价阳离子

对于反转录酶活性来说,二价阳离子也是必需的。产生全长cDNA产物的最适浓度是6-10 mM。

4.dNTP

四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)的浓度,对于有效合成cDNA是至关重要的。如果其中只有一种的浓度小于10-50 μM,cDNA的产量将明显下降。常用的dNTP的浓度为200-500 μM。

5.引物的选择

逆转录引物一般包含三种:oligo dT,随机引物(Random Primer Mix)和基因特异性引物(GSP)。客户可以根据个人需求进行选择。

6.gDNA去除

污染性gDNA可能会干扰逆转录反应,并导致后续的PCR实验、qPCR实验结果出现假阳性、高背景或检测率降低等现象。通常在RNA提取过程中加入合适浓度的DNase I,37℃加热10~15 min,去除gDNA干扰。

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